2012年1月,由LGR公司發(fā)明的專利Method For Analysis Of Isotopes In Bodily Fluids(專利號(hào):9110008)在美國(guó)獲得批準(zhǔn)。專利發(fā)明人Douglas Steven Baer及其伙伴創(chuàng)造性的應(yīng)用LGR水同位素分析儀912-0032,成功的測(cè)量了生物體細(xì)胞液中的氫氧同位素δ18O,?δ17O和δ2H。該方法區(qū)別于傳統(tǒng)的同位素比質(zhì)譜儀法,不會(huì)在對(duì)樣品的前處理過(guò)程中產(chǎn)生分餾,同時(shí),測(cè)量結(jié)果也不會(huì)受到細(xì)胞液中其他物質(zhì)的干擾。
其基本前處理方法如下:
將30~250?μL(典型為200?μL)的樣品加入到離心管中,加入5 mg ZnSO4,以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心10 min,取10~75?μL上清液,然后直接用LGR水同位素分析儀(912-0032)進(jìn)行測(cè)定。加入ZnSO4是為了沉淀蛋白質(zhì),原理是金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)有親和作用,可以引發(fā)形成蛋白質(zhì)交聯(lián),形成沉淀,也可用到其他金屬離子如(Ca / Al / Cu),陰離子一般用氯化物或者是硫酸根。同時(shí),該專利中還提到,以前的一些分離蛋白質(zhì)的方法不適合用此設(shè)備,具體方法如下:
1、用鹽析來(lái)沉淀蛋白質(zhì),鹽析去除效率只有90%,并不完全,并且高濃度的鹽本身對(duì)測(cè)試結(jié)果會(huì)有影響;
2、有一種稱之為Cohn process的方法,通過(guò)加入乙醇或者其他有機(jī)溶劑(甲醇、丙酮、乙二醇、三氯乙酸、肼)來(lái)沉淀蛋白質(zhì),乙醇的加入導(dǎo)致PH降低,蛋白質(zhì)被沉淀下來(lái),但是乙醇或其他類似有機(jī)溶劑中的H會(huì)與H2O中的H發(fā)生置換反應(yīng),影響測(cè)定結(jié)果,這可能就是之前提到的為啥醇類物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果會(huì)有影響的原因;
3、通過(guò)有機(jī)聚合物來(lái)沉淀蛋白質(zhì),該有機(jī)物通常是聚乙二醇,同上,同樣不適用;
4、通過(guò)加酸到樣品中,與蛋白中的氨基形成不溶性的鹽,但是酸化后形成的NH4+中的H同樣會(huì)與H2O發(fā)生置換反應(yīng);
5、絮凝。通過(guò)加入藻酸鹽、角叉菜膠、單寧酸來(lái)去除蛋白質(zhì),該方法產(chǎn)生的效應(yīng)與Cohn process一樣。